АНТОН ГУРКОВ, НАУЧНЫЙ СОТРУДНИК НИИ БИОЛОГИИ ИРКУТСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Нанотехнологии на страже Байкала: как это возможно?

Чем показателен уровень pH и какие выводы можно делать при его исследовании у рыбок и рачков? Как нанотехнологии могут применяться для исследования состояний животных? Будущее микрокапсул в научных исследованиях.
Поделитесь лекцией в соцсетях:
Почему для нас так важны пресноводные водоемы? Во-первых, это ресурс той воды, которую все мы пьем. Кроме того, это место, где мы добываем рыбу, которую едим. Помимо прочего, пресная вода — это ресурс для многих технологических процессов. В том числе для работы гидроэлектростанций, для химического синтеза и так далее.

Что плохого человек может сделать с водоемом в результате своей деятельности? Во-первых, мы можем напрямую загрязнять водоем стоками химических предприятий, бытовыми стоками, а это приводит к гибели животных, которые его населяют.

Кроме того, существует такое явление как эвтрофикация. Это процесс взрывного развития водорослей за счет того, что в водоем сливают большое, нетипичное для него количество разных питательных веществ. Из-за этого водоросли развиваются настолько быстро и мощно, что начинают выделять некоторые токсины, а в какой-то момент эти водоросли начинают гибнуть, разлагаться и окончательно «добивают» остатки естественной экосистемы, которые были там до того.

Уникальный ресурс пресной воды — это озеро Байкал. Все мы знаем, что это самое древнее и глубокое пресноводное озеро на нашей планете. Кроме того, в Байкале обитает огромное количество эндемичных организмов — животных и растений, которые обитают только в этом месте. И что самое важное — Байкал содержит примерно 20% всех доступных мировых запасов пресной воды. Замечу, что качество этой пресной воды сильно зависит от того, насколько естественно функционирует та экосистема, которая в Байкале сложилась за миллионы лет, которые существует это озеро. Соответственно, если мы хотим сохранить эту воду не только для себя, но и для следующих поколений, нам необходимо постоянно отслеживать состояние экосистемы Байкала, для того чтобы убедиться, что с ней все в порядке.

Влияние негативных факторов на экосистему
Как различные негативные факторы влияют на компоненты экосистемы и на экосистему в целом? Сначала фактор начинает воздействовать на организм на клеточном уровне, затем его воздействие переходит на уровень всего организма, потом начинаются изменения в популяции того вида животных (и не только животных), на которых оказал влияние этот фактор. Ну и в итоге мы наблюдаем изменения на уровне всей экосистемы.

Подавляющее большинство современных методов мониторинга экосистем работает на уровне всей экосистемы и на уровне популяций отдельных видов. Недостаток такого подхода состоит в том, что он позволяет отслеживать только те изменения, которые уже произошли. Но если мы хотим эти изменения каким-то образом предотвратить, то нужно попытаться обнаружить воздействие негативного фактора на организменном уровне, а еще лучше — на клеточном. Именно этим вопросом занимается последние 20 лет огромное количество биологов.

В том числе и наша исследовательская группа активно работает в области различных клеточных биомаркеров загрязнения водоемов. Проблема работы с биомаркерами состоит в том, что их довольно трудно интерпретировать. Так что именно организменный уровень на сегодня является наиболее верным инструментом для отслеживания физиологических параметров тех организмов, которые обитают в конкретной экосистеме.

Подходы к мониторингу экосистем и их нюансы
Однако в работе на организменном уровне есть небольшой нюанс. В том случае, если мы хотим отслеживать какой-то внутренний физиологический параметр объекта исследования, нам это несчастное животное нужно сначала убить. Причина в том, что размеры большинства гидробионтов слишком малы для того чтобы проводить многократный забор образцов их крови или их ткани. Это означает, что мы просто не можем отслеживать в динамике изменение, которое происходит в одном и том же организме. Получается, что для исследования необходимо достаточно много животных и при этом мы не можем отследить индивидуальные реакции различных животных.

Для того чтобы решить эту проблему, существует один очень интересный подход: небольшие оптические микросенсоры можно ввести напрямую в кровеносную систему объекта исследования и в динамике смотреть изменения физических параметров объекта дистанционно. Концепция имплантируемых оптических микросенсоров пришла из наиболее передовой части биологических исследований — из биомедицины, однако наша группа является первой, которой удалось использовать наработки в области оптических микросенсоров на водных объектах — на гидробионтах.

Первым параметром, который мы начали дистанционно отслеживать непосредственно в живом организме стал pH, или кислотно-щелочной баланс, pH — это один из важных физиологических параметров, определяющих все биохимические реакции в любом организме. Сдвиг pН сигнализирует о существенных изменениях в организме, это нам как раз и нужно отследить.

Флуоресценция как инструмент для исследований
Большинство оптических микросенсоров основываются на таком явлении, как флуоресценция — свечение вещества сразу после освещения светом более короткой длины волны. Флуоресценция бывает разных цветов. На основе флуоресцентных красителей можно получать так называемые молекулярные флуоресцентные сенсоры. Спектр флуоресценции этих сенсоров специфично чувствителен к изменению параметров раствора.

Краситель, который часто используют в биологических исследованиях, например, на клеточных культурах, для измерения pH — SNARF-1. Его молекула в растворе существует в двух формах: протонированной и депротонированной, и каждая из этих форм обладает собственным спектром флуоресценции с пиком на разных длинах волн. Это значит, что в зависимости от pH в растворе меняется соотношение этих двух форм красителя, и по соотношению интенсивности флуоресценции на двух пиках можно измерить pH в растворе.


Со свободными молекулярными сенсорами есть небольшая проблема. В том случае, если вы введете их во взрослый живой организм, они растворятся во всех его средах, и сигнал на выходе будет слишком слабый. Если пытаться довести концентрацию красителя до детектируемой, встает вопрос о токсичности этого сенсора для объекта исследования. Очень перспективным подходом для решения этой проблемы является иммобилизация молекулярных сенсоров внутри полупроницаемых микрокапсул. И вот здесь в игру вступают современные нанотехнологии.
Нанотехнологии в биологических исследованиях
Как собственно заключить флуоресцентный краситель в микрокапсулу? Для этого сначала краситель, сшитый с каким-то полимером, например, с декстраном, преципитируют в пористые микроядра карбоната кальция, а затем эти микроядра покрывают полимерной оболочкой из двух противоположно заряженных полиэлектролитов. По факту микроядра просто помещают в растворы полиэлектролитов последовательно, что позволяет создать сетчатую полимерную пленку общей толщиной около ста нанометров. Затем ее покрывают финальным слоем специального биосовместимого полимера для того, чтобы снизить иммунную реакцию организма на вводимые микрокапсулы. И затем растворяют исходные ядра, для того чтобы получить полую микрокапсулу с мягкой стенкой, содержащую нужный для исследования молекулярный сенсор.

С помощью такой технологии вполне можно получать не только микрокапсулы, но и нанокапсулы. Но есть две проблемы: во-первых, наночастицы размером от 200 нанометров и меньше обладают повышенной токсичностью для клеток организма, поскольку легко проникают через мембраны, а во-вторых, их довольно сложно под обычным флуоресцентным микроскопом отличить от прочих флуоресцирующих частичек в организме.

Микрокапсулы размером в несколько микрон лишены обоих этих недостатков, но в то же время они достаточно малы, для того чтобы легко распространяться в кровеносной системе животного. По размеру они в несколько раз меньше, чем типичная клетка эукариот, но при этом обладают мягкой стенкой, которая позволяет им протискиваться даже в самые тонкие капилляры.

В качестве объектов исследования для первого тестирования имплантируемых микросенсоров на гидробионтах мы выбрали два вида животных. Первый — байкальский эндемичный вид амфипод или рачков, Eulimnogammarus verrucosus. Это небольшие зеленые рачки длиной два-три сантиметра. Мы их отлавливаем в прибрежной зоне озера Байкал, привозим в лабораторию, содержим там в аквариумах в необходимых для исследования условиях.

Второй вид — типичный лабораторный объект — рыбка Danio rerio. В Байкале она не обитает, однако, это очень удобный модельный объект, для того чтобы протестировать исходную технологию, а потом наработки можно перенести и на эндемичные виды байкальских рыб.
Как ввести микросенсор в рыбку?
Для того чтобы измерить какой-то параметр с помощью имплантированного микросенсора, этот микросенсор нужно сначала увидеть в тканях организма. Чтобы ввести микросенсоры в рачков, мы использовали инъекцию в центральный кровеносный сосуд и затем в нем же визуализировали эти микросенсоры.

В случае рыбок мы специально разработали методику инъекции в почку, благодаря чему микросенсоры попадают напрямую в кровеносную систему рыбки и затем их можно визуализировать в капиллярах жабр, если удалить жаберную крышку. Рыбка без жаберной крышки живет замечательно, несколько лет как минимум, по крайней мере, в условиях аквариума. Ей это никак не мешает, однако нам помогает увидеть микросенсоры, которые мы ввели. Обычно мы используем концентрацию примерно в несколько десятков микрокапсул на одну жабру.

Чтобы получить спектральный сигнал от микросенсоров, мы помещаем объекты исследований под флуоресцентный микроскоп, такой вы можете найти практически в любой биологической лаборатории. Есть только одно существенное отличие: к нему подключен оптоволоконный спектрометр, в него мы можем направить весь свет из микроскопа и снять спектральный сигнал флуоресценции микросенсоров непосредственно в живом организме.

Как обездвижить рачка?
Амфиподы и рыбы — подвижные животные, поэтому, чтобы увидеть микросенсоры в их кровеносной системе, животных нужно каким-то образом обездвижить под объективом микроскопа. Для того чтобы иммобилизовать рачков, амфипод, мы используем специальную ячейку, из центра которой откачивается вода, благодаря чему рачок присасывается к центру и фиксируется, и мы можем исследовать под микроскопом те микросенсоры, которые находятся у него в кровеносной системе.

В случае рыб удалось использовать анестезию, это проще. Рыбка засыпает, и затем мы кладем ее под объектив микроскопа, наводимся микроскопом на жабры и снимаем флуоресцентный сигнал с микросенсоров в капиллярах жабр.

Сложности исследований с микросенсорами
В нашей работе мы встретились с некоторыми проблемами, которые успешно решили. Проблема №1: при исследованиях амфипод мы обнаружили довольно существенную автофлуоресценцию тканей самих амфипод. Это значит, что прямое измерение pH с помощью флуоресценции SNARF-1 становится некорректным, поскольку автофлуоресценция влияет на спектральный сигнал и искажает его. Однако выяснилось, что автофлуоресценция амфипод в диапазоне от 600 до 650 нанометров довольно стабильна. Благодаря этому спектральный сигнал, который мы получаем от имплантированных микросенсоров внутри амфипод, можно разложить на три базовых спектра: на спектр протонированного SNARF-1, спектр депротонированного SNARF-1 и на спектр автофлуоресценции. Мы вычитаем спектр автофлуоресценции и применяем заранее полученную калибровочную линию, для того чтобы измерить pH прямо в кровеносной системе.

К слову о калибровочной линии — с ней у нас тоже были небольшие проблемы, но в случае рыб. У рачков, амфипод, показания микросенсоров как в калибровочных буферных растворах in vitro, так и в экстрагированной гемолимфе совпали. Значит, калибровочную линию мы могли напрямую применить для измерения pH внутри рачков.

В случае рыбок показания не совпали. Мы предполагаем, что это связано с влиянием тех белков, которые находятся в крови рыбок. Однако, в любом случае наши данные показывают, что мы можем просто ввести дополнительный поправочный коэффициент примерно 0.6 и сдвинуть калибровочную линию. Благодаря этому мы можем использовать ее для измерения pH в живой рыбке.

Перед нашими экспериментами мы протестировали реакцию амфипод и рыб на инъекцию микрокапсул и выяснили, что в течение как минимум нескольких недель ни те, ни другие не начинают гибнуть сильнее, чем обычно.

Кроме того, предварительное тестирование иммунного ответа показало, что у амфипод, по всей видимости, реакции на эти микрокапсулы нет, биосовместимое покрытие помогло. В случае рыб мы обнаружили фагоцитоз существенной части микросенсоров примерно к 20 часам эксперимента после инъекции. Это говорит о том, что все-таки наше биосовместимое покрытие все еще требует доработки. Но уже сейчас микросенсоры можно применять для измерения физиологических параметров рыб как минимум в течение нескольких часов.

Для того чтобы протестировать чувствительность наших pH-сенсоров к изменениям pH в кровеносной системе и рачков, и рыб, мы подвергли оба вида животных экспонированию при повышенном содержании углекислого газа. Такая экспозиция должна приводить к наиболее выраженному снижению pH в кровеносной системе, и это мы и наблюдали. В случае амфипод произошло снижение медианного pH с 8.2 до 7.7. У рыб мы наблюдали похожую картину, кровь закислилась, как и в случае амфипод, в то время, как pH в контрольной группе остался стабильным, как и у амфипод. Это значит, что мы можем использовать pH-чувствительные микросенсоры для отслеживания физиологических параметров внутри ракообразных и рыб в течение, как минимум, нескольких часов после инъекции.

Новые виды микросенсоров для исследований
Сейчас мы тестируем другие микросенсоры. Во-первых, сенсоры, чувствительные к кислороду. Что важно, при комбинировании этого микросенсора с некоторыми ферментами, мы можем получить сенсор на лактат, который является важным маркером стрессового состояния для ракообразных, а еще полезен для спортсменов.

Кроме того, мы можем получить на его основе сенсор на глюкозу, которая также является важным маркером метаболических процессов в организме животных, а у людей интересна для отслеживания уровня глюкозы в крови больных сахарным диабетом.

В более отдаленной перспективе мы планируем протестировать и другие флуоресцентные красители. Например, чувствительные к таким параметрам как тяжелые металлы. Это тоже очень важный параметр в аспекте антропогенного загрязнения водоемов.

Мы знаем, что в случае амфипод существует проблема автофлуоресценции. Если говорить о других объектах исследования, таких как человек и растения, проблема автофлуоресценции становится просто безумной. Очень сложно получить какой-то сигнал от микросенсоров, введенных под кожу человека или в лист растения, просто потому что они сами ярко флуоресцируют.

В лаборатории мы сейчас тестируем новый подход — комбинирование молекулярных сенсоров внутри микрокапсул с так называемыми апконверсионными наночастицами, которые могут позволить полностью решить проблему автофлуоресценции как в случае ракообразных, так и в случае других объектов.

Мы надеемся в какой-то момент протестировать еще и биосенсоры. Уже созданы некоторые штаммы микроорганизмов — бактерий, дрожжей и прочего, чья флуоресценция оказывается чувствительной к некоторым важным параметрам, таким как некоторые тяжелые металлы. У нас есть идеи, как сделать их более биосовместимыми и менее иммуногенными для тех объектов, в которые мы можем их вводить и использовать наряду с другими флуоресцентными сенсорами.

Применение микросенсоров в науке и не только
В Байкале не обитают ни рачки, ни рыбы с имплантированнми микросенсорами, но в озере можно использовать эту технологию в мезокосмах. Мезокосмы – это очень популярное направление в современной гидробиологии, это такие небольшие участки экосистемы, изолированные от остального побережья с помощью специальных сеток. Туда помещается часть животных, и можно следить за тем, как они себя чувствуют. Их можно вынимать оттуда, периодически снимать их физиологические параметры, а может и когда-нибудь в реальном времени отслеживать их состояние прямо в воде. Но это уже вотчина робототехники.

Кроме того, с помощью нашей методики имплантированных микросенсоров можно тестировать воздействие воды из различных участков прибрежной зоны Байкала на эндемиков. Таким образом можно, например, отслеживать уровень загрязнения воды.

В текущем состоянии методика имплантированных микросенсоров может быть применена для мониторинга и других водных экосистем, не только Байкала, но и в аквакультуре на тех рыбах и креветках, которые разводятся для получения пищи.

Во многих странах сейчас существует целая коммерческая индустрия тестирования новых химических соединений на их токсичность для гидробионтов. Потому что все то, что мы с вами используем в косметике, в лекарствах, в бытовой химии попадает потом в стоки и травит экосистемы водоемов. Во многих странах сейчас принято, прежде чем выводить какой-то новый химический препарат на рынок, тестировать их на токсичность для водных объектов и организмов. Как раз в этой области может помочь наша методика имплантированных микросенсоров: чтобы отслеживать в динамике состояние тех организмов, на которых тестируют химические препараты.

Микрокапсулы, в которые иммобилизуются флуоресцентные микросенсоры, имеют большой потенциал для применения и в биомедицине, поскольку у них есть некоторые преимущества по сравнению с теми микросенсорами, которые раньше использовались для отслеживания физиологических параметров мышей, например, глюкозы у больных диабетом либо некоторых ионов у больных с почечной недостаточностью. Это так называемая концепция «умных тату», когда вы вводите имплантированный микросенсор под кожу человека, для того чтобы в реальном времени с помощью специального браслета отслеживать его физиологические параметры и проверять, как он себя чувствует.

Такие же имплантированные микросенсоры можно использовать и в вертикальных фермах, для автоматизации некоторых процессов: оптимизации полива, оптимизации минерального состава воды, которую используют для выращивания растений, оптимизации режима светового дня и многого другого.

Другие лекции сессии «Энергия Сибири»
© 2017 En+ Group Ltd.
Образовательный проект. Проект группы компании En+ Group Ltd.